[01382120]多种植物生长调节剂诱导雨生红球藻高效生产虾青素的研究

雨生红球藻能迅速合成目前自然界发现的最强抗氧化剂--天然虾青素,它广泛应用于水产养殖、医药、化妆品和功能性食品等领域。雨生红球藻是公认的生产天然虾青素首选工具,但对于工业化生产而言,其合成效率还是太低,导致目前生产成本太高和价格居高不下的局面。找到高效可靠的诱导雨生红球藻积累虾青的途径,弄清它的分子调控机制是攻克这一瓶颈的关键。植物生长调节剂（植物激素）对植物生长、发育和次生代谢物有显著调控作用。它们被广泛用来增加高等植物的生物量、提高品质、增加抗性、调节细胞的分裂和增殖、刺激相关次生代谢产物产量等,因此它们很可能也是微藻次生代谢物的高效诱导因子,但在藻类中的应用还非常少,取得的进展还远远滞后。本成果从植物生长调节剂能够诱导雨生红球藻高效积累虾青素这一全新角度,创造性地将广泛应用于高等植物尤其是农作物上的研究策略,借鉴到低等的单细胞雨生红球藻上。 我们利用真核藻类的遗传转化技术,建立了以lacZ为报告基因、基因枪转化的雨生红球藻遗传转化体系;应用GenomeWalker技术,成功克隆了雨生红球藻中虾青素合成途径几个关键酶基因（ipi、 bkt、crtO、crtR-B）的5’上游侧翼序列,分析了它们包含的功能元件;结合该藻外源基因表达体系,分发现β-胡萝卜素酮化酶基因（bkt）和β-胡萝卜素羟化酶基因（crtR-B）5’上游侧翼序列中具有较强转录活性的启动子区域,包含植物生长调节剂调控相关的顺式作用元件,如生长素（IAA）反应元件、水杨酸（SA）反应元件、茉莉酸（JA）反应元件、赤霉素（GA3）反应元件、脱落酸（ABA）反应元件和乙烯（ETH）反应元件等。我们用实验证实这些植物生长调节剂均能高效诱导雨生红球藻大量积累虾青素,初步明晰了JA和SA调控雨生红球藻高效积累虾青素的分子机制。 qRT-PCR研究表明SA和JA均能显著促进8个虾青素合成相关酶基因（ipi-1、ipi-2、psy、pds、lyc、bkt、crtR-B、crtO）的转录上调。SA和JA诱导红球藻积累虾青素受到psy、bkt、crtR-B、crtO在转录水平上的调控;但不同的是SA还会诱导ipi-1、ipi-2在转录水平,lyc在转录后水平和pds在转录与转录后水平的双重调控虾青素的合成;而JA还诱导pds、lyc在转录水平,ipi-1、ipi-2在转录和转录后水平的双重调控虾青素的合成。 高通量转录组测序发现SA和JA均是通过相关基因差异表达来影响红球藻积累虾青素的。SA1、SA6 和SA24处理中上调的差异基因分别为30、145和264个。转录下调的基因在SA1、SA6 和SA24处理中达到58,892和745。JA1、JA6和JA24处理中上调差异基因分别有14、889和862个;JA1,JA6和JA24处理中下调差异基因分别有109个、305和226个;胡萝卜素代谢途径分析发现JA6诱导zds、crtZ、pds 和 crtR-B显著上调,zep显著下调;虾青素代谢途径分析发现psy、 pds、zds、crtR-B和bkt/crtO在JA6中的转录上调与虾青素积累有直接关系。 高通量差异蛋白质组iTRAQ分析结果筛选出了37个SA介导的转录因子,包括MYB、B 3、E2F/DP、ERF、HSF、C3H、NF-YB、NF-YC、WRKY等,其中MYB、WRKY、E2F/DP 和HSF与SA诱导红球藻积累虾青素直接相关。同时筛选出了61个属于24个不同家族JA相关转录因子,包括MYB、AP2/ERF、NAC、GRAS、B3, E2F/DP、MADS、HSF WRKY、C3H、bHLH 和FAR1等,其中MYB和 WRKY可能直接参与JA诱导红球藻信号转导,与虾青素的积累线性相关,TCP（1）、YABBY（2）、SBP（2）是JA诱导所特有的。 目前我们就该项研究已发表SCI文章10多篇,申请相关国家发明专利3项,授权1项,并积累了具备转化潜力的成果。