[00987529]抗CTLA-4的纳米抗体Nb91及其制备方法与应用

1、课题来源与背景：该项目是国家“长江学者和创新团队发展计划”创新团队项目滚动资助，合同编号：IRT_15R13。 2、技术原理及性能指标：该发明涉及生物医学领域中抗CTLA-4的纳米抗体Nb91及其制备方法与应用。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymph℃yticASSoCiatedantigen，CTLA-4/CTLA4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是活化T细胞表面表达的一种跨膜糖蛋白分子，属免疫球蛋白超家族成员，对T细胞增殖起负性调节作用，在免疫应答中起重要调节作用。CTLA-4Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应、肿瘤及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是被认为较有希望的新的免疫抑制药物。纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子。1993年Hamers等报道，骆驼体内存在着天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的重链抗体，克隆其可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH(variable domain of heavychain of heavy-chain antibody)，现已被重新命名为“纳米抗体”(nanobody，Nb)。纳米抗体具有完整功能的最小的抗原结合片段，其晶体结构呈椭圆形，直径2.5nm，长4nm。Nb具有许多独特的性质，很适合进行基因改造，在疾病的精确诊断和靶向治疗等方面展现了广阔的应用前景。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成。纳米抗体对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低。纳米抗体的独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。 3、技术的创造性与先进性：该发明公开了抗CTLA4的纳米抗体Nb91及其制备方法与应用。该方法包括：将编码抗CTLA-4的纳米抗体Nb91的核酸分子导入受体细胞得到表达所述Nb91的转基因细胞，培养所述转基因细胞，得到抗CTLA-4的纳米抗体Nb91。该发明公开了针对于CTLA-4多肽分子抗原表位的一种纳米抗体(Nb91)，同时还公布了编码该纳米抗体的基因序列以及能够表达该纳米抗体的宿主细胞。该发明所提供的纳米抗体，包含决定簇互补区和框架区；所述纳米抗体的决定簇互补区由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述CDR1的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.7的第2632位氨基酸；所述CDR2的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.7的第4855位氨基酸；所述CDR3的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.7的第94106位氨基酸。该发明的纳米抗体Nb91可以与T细胞及CTLA4结合，可应用于CTLA4分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CTLA4活性和促进T细胞增殖的药物。使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。 4、技术的成熟程度，适用范围和安全性：该发明提供了来源于骆驼的纳米抗体，其名称为Nb91。Nb91可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述Nb91的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.8的第1-351位核苷酸或SEQ ID No.8所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。用于于生物表达的各种生物材料的载体如质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体等。均可从商业途径得到。而大肠杆菌WK6则经东南大学生命科学研究院万亚坤实验室同意后，可从广西医科大学获得。纳米抗体在化学组成和形状上比抗体简单许多，不具有化学疏水性，其抗热性和抗酸碱性更强，更容易相互结合或与其他化合物结合，能被单基因编码，容易用微生物合成；且对环境具有良好的耐受性，具备高度的构象稳定性，而且分子质量更小，临床的治疗效果更好，同时这些小蛋白分子更容易合成，价格也更低；纳米抗体独特的性质，使其在疾病的精确诊断和免疫靶向治疗等方面展现了更为广阔的应用前景。 5、应用情况及存在的问题：该纳米抗体(Nb91)能够在大肠杆菌内高效表达，可以与T细胞及CTLA-4结合，可应用于CTLA-4分子检测试剂的研发，制备肿瘤抑制剂或肿瘤细胞抑制剂以及制备抑制CTLA-4活性和促进T细胞增殖的药物。抗体药物应用存在很多问题，比如研发周期长，生产成本过高；难以大规模生产；稳定性差易降解，贮存成本高；容易被污染，维护成本费用高昂；并具有免疫原性等，限制了其在临床上的应用范围。