[00384099]生防芽孢杆菌几丁质酶表达调节的分子基础

该研究旨在确定Bt几丁质酶表达方式的基础上，研究该基因的遗传调控元件，从而为揭示几丁质酶基因表达调节机理提供理论依据。为了对生防芽孢杆菌几丁质酶的表达方式有系统、全面的了解，采用DNS法检测了104株菌在有或无诱导物培养基中的几丁质酶活力，经过对数据的归纳分析后，首次发现了芽胞杆菌几丁质酶基因表达调控的多态现象。为研究chi基因表达调节的分子基础，需要构建一个带有无启动子报告基因的载体。将基因bgaB作为报告基因，在穿梭载体pHT315的骨架上构建了载体pCB。并证明该载体完全可以开展该研究计划的后续所有工作。通过对chiA调控序列的一系列缺失突变子对酶活力影响的分析，发现调控区域中长75bp的序列是chiA基因的核心启动子。研究发现和证实在核心启动子下游、-20bp处上游附近存在一个应答几丁质诱导的负调控位点，缺失或破坏这个位点导致chiA启动子引起酶的组成型表达。另外，通过5′RACE技术，证实chiA启动子内-46bp处的“A”碱基是基因的转录起始位点，由此确定chiA启动子的-35区和-10区分别为“TTACAA”和“TATCAT”，间隔17bp。通过对chiB调控序列的一系列缺失突变子对酶活力影响的分析，证实chiB调控序列中112bp，既从上游-232至-121bp位点之间的序列为基因的核心启动子。同时证实chiB基因转录起始位点为-132bp处的“C”碱基。chiB基因启动子的-35区和-10区序列分别为“TTTACA”和“TACGAT”，间隔17bp。缺失分析发现，chiB基因内存在一个16bp应答几丁质诱导的负调控位点-dre(AGACTTCGTGATGTCT)。该位点是一个保守序列，具有部分反向重复序列的特点。缺失或部分缺失这个序列导致chiB启动子为组成型表达，因此证实dre位点参与了chiB基因诱导表达的调节，通过体外凝胶电泳迁移率变动分析证实，Bt存在一种蛋白，在无诱导物的情况下能够结合包括dre位点在内的调控区域。同时发现和证明，其中一些碱基对于dre位点行使功能起着至关重要的作用。上述有关chiA、chiB基因表达调节关键遗传元件的研究结果，为深入研究调控蛋白，为最终提出Bt几丁质酶表达调控模型提供了研究基础。