[01737113]青藏高原牛羊重大疫病现场荧光PCR诊断技术的研究和应用

本项目对PCR共性关键技术环节进行改进和集成创新,研发出适合青藏高原动物疫病现场诊断的新型荧光定量PCR技术和试剂盒,实现疫病诊断轻减化、便捷化和现场化的目标。主要开展以下四方面内容：1)核酸提取技术的轻减化,适应现场提取的要求;2)青藏高原牛羊重要疫病分子诊断靶基因的筛选;3)建立恒温热隔绝式荧光定量PCR检测方法;4)研制适于现场诊断试剂盒。 技术原理和关键主要包括以下三个方面。 1)轻减化核酸提取方法的研究：通过改进裂解液和洗脱液,研发无需离心环节的DNA\RNA共提取试剂,但是不进行离心,排除样本中其他物质对后续PCR反应的影响,是提取方法研究的技术关键。 2)恒温热隔绝式荧光定量PCR检测引物和探针的设计：在进行恒温热隔绝式荧光定量PCR引物和探针的设计的时候既要保证引物和探针的特异性和通用性,还要保证引物和探针对于恒温热隔绝式荧光定量PCR的适用。 3)冻干保护剂和冻干工艺研究：此研究的技术关键是冻干保护剂和冻干工艺既要保证最终的冻干效果,又要保证过程中不影响聚合酶的活性,进而影响后续PCR扩增。 创新性：本项目对荧光定量PCR检测的共性关键技术“现场化”研究具有显著的新颖性,对核酸提取、PCR检测扩增及检测试剂盒制备工艺的集成创新是本项目最大的创新点,而针对青藏高原动物疫病病原基因序列变异大而严重影响现有PCR检测方法的准确性的现状,通过对青藏高原动物疫病流行菌毒株的遗传进化分析,建立适合青藏高原牛羊重要疫病的现场荧光定量PCR诊断方法和系列诊断试剂盒则是本项目的鲜明特色,具有不可替代性。 应用前景：研发出的新型现场PCR检测技术操作简便,15min 内即可在完成核酸提取,检测试剂单份次独立包装,各组分集成冻干,仅需加入稀释液和核酸模板混匀后转入PCR反应管内,置PCR仪内仅需按下启动键即可在1h内完成检测,结果直接在PCR检测仪显示屏上显示,因此,对检测人员的技术不高,特别适合基层特别是青藏高原这种地广人稀,兽医技术人员薄弱的地区的动物疫病的现场诊断,为疫病防控争取更多的时间,应用前景广阔。在四川、西藏、青海、甘肃等牦牛和藏羊主产区的动物疾病控制中心、畜牧局、兽医站、大型养殖场等应用,效果显著。 存在的问题和打算：将研制的轻简化核酸提取试剂盒、恒温热隔绝式荧光定量PCR试剂盒组装、小型化PCR仪、小型离心机以及移动电源集成研发现场PCR诊断箱,实现PCR诊断技术的现场化,缩短诊断时间,为青藏高原牛羊重要疫病的早期防治赢取时间,降低疫病造成的损失。