[01526735]无唾液酸糖蛋白受体介导拉咪呋啶的肝靶向性及其抗乙型肝炎病毒作用

该项目为山东省教育厅2005年立项资助的课题，项目编号为（J05L16）。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一种严重危害人类健康的全球性疾病，全世界大约有20亿人感染过HBV。在我国HBV感染率高达60～76%，其中约有10%发展为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）携带者，而HbsAg慢性携带者长期携带HBV，一方面对周围健康人群造成威胁，另一方面，自身可进一步发展为慢性肝炎、原发性肝癌。近年来，随着乙肝疫苗的逐步推广应用及献血筛查制度的逐步完善，对新发HBV感染人数的控制已初见成效，但由于正常人接种乙肝疫苗后总有5～10%患者会出现无弱应答，这部分人易于形成乙肝慢性感染者；加之众多已感染HBV者及因母婴垂直传播等因素所致的部分新感染病例，因此，在今后几十年中治疗乙肝的任务仍是非常紧迫而艰巨的。乙肝治疗的根本措施是抗病毒，抗HBV药物的药物种类繁多，如化学药物、中草药有效成分及单味中草药、生物类药物等，然而大多数都疗效甚微，甚至无效，而且具有明显的副作用，因此寻找安全有效的抗HBV药物已成为当今医药学界一项迫切任务。拉咪呋定（LAivudine,LA）是近年来抗HBV研究的热点，有很强的抗嗜肝DNA病毒的作用，表现出了良好的应用发展前景；LA作为一种新的抗HBV药物[3,4]，其疗效已得到公认。然而，LA的作用只能阻断HBV复制过程中的中间环节，不能清除肝细胞内及肝外组织细胞中HBV的复制源cccDNA，同时对整合入宿主细胞基因的HBV DNA亦无能为力，对肝细胞内病毒状态似无影响，而HBV具有明显的嗜肝性，故大大降低了拉眯呋定的抗HBV作用，因此，提高肝脏细胞中拉咪呋啶的药物浓度是其抗HBV作用的关键所在，也是我们研究的重点所在。鉴于无唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）是一种存在于哺乳动物肝细胞膜上的跨膜糖蛋白，它能与半乳糖基新糖蛋白（NGA）特异性结合，而且其结合具有可逆性、高度的种属特异性和组织特异性，可使NGA在肝脏的摄取率高达82%。研究证明，核苷可以与NGA偶联，而拉眯呋定也具有核苷环，因此将拉咪呋定与NGA偶联不但十分必要（能明显提高拉咪呋定在肝细胞内的浓度），而且具有很强的可行性。基于此，本研究拟通过一定的化学偶联反应将拉咪呋定用NGA偶联修饰，利用ASGP-R和NGA特异性结合的特性，通过配体NGA将拉咪呋定特异性载入肝细胞内。这一研究不仅能大大提高拉咪呋定的抗HBV效果，而且为其它靶向药物的研制提供一种可行的思路，因此，该研究不仅具有重大的社会价值和经济价值，而且具有重要的理论意义。结果：1.偶联物分子量经sephadexG-100凝胶过滤法初步确定约为56Kd，偶联物中乳糖及拉咪呋啶（简称 LA）的含量分别为28.07±1.26%，10.02±0.63%。药物/载体的摩尔比约为28。与拉咪呋啶相比偶联物的水溶性大大提高，在生理盐水中的浓度可达200mg/ml。2.HPLC法色谱条件：BeckmanGold系列高效液相色谱仪，ODS柱，流动相为甲醇一水（5:95,V/V），流速1.Oml/min，检测波长254nm，柱温为室温。LA标准品的保留时间tR=7.50min，血浆及组织样品的内源性物质对标准品无干扰：LA浓度与峰面积的线性关系良好（r=0.99），线性范围为0.1～20kg/ml(g)；血浆和组织匀浆的最低检测浓度分别为20ng/ml，50ng/g；方法的天内及天间精密度变异系数均低于6%；方法平均回收率为100.35%。3.偶联物在新鲜人空白血浆中37℃保温1小时后，游离药物的浓度仅占偶联拉咪呋啶总量的3%，4小时后仅占6%。4.两种标记药物在体内主要脏器放射性分布基本相同，放射性药物在肝脏、肾脏的分布明显高于其它脏器。随着时间延长，肝脏、肾脏的放射性逐渐下降，肠道中的放射性逐渐浓聚，表明两种探针主要通过肝脏、肾脏排泄。在整个过程中，血、心、肺、脾、骨骼肌和甲状腺的放射性分布较低，随时间推移缓慢下降。注射99mTc 标记的Lac-PLL-LA后1～6h，肝脏/血液和肝脏/骨骼肌放射性比值分别从1.24、2.28上升到4.1、12.1，注射99mTc-LA后1～6h，肝脏/血液和肝脏/骨骼肌放射性比值分别从0.28、0.55上升到0.49、1.36。各时间点99mTc 标记的Lac-PLL-LA肝脏/血液和肝脏/骨骼肌放射性比值均高于99mTc-LA 约10倍，两组数据用t检验分析，相差非常显著（p＜0.01）。5.慢性乙型病毒性肝炎小鼠注射99mTc 标记的Lac-PLL-LA和LA 7.4MBq 0.5h后，即可见肝脏部位有显像剂聚集，随时间延长，2h及5h肝脏显像更清晰，肝脏与对侧肌肉放射性计数的比值逐渐增加。慢性乙型病毒性肝炎小鼠注射99mTc 标记的LA 0.5h、2h及5h后肝脏部位显像模糊不清，各时间点99mTc 标记的Lac-PLL-LA组小鼠肝脏部位显像剂的聚集程度均明显高于99mTc 标记的LA组，两组显像剂的聚集程度差异有显著性（P＜0.01）。6.作用5天时，与LA比较，Lac-PLL-LA血清1:1组抗HBV作用优于LA组（HBsAg: 53.93±1.34 vs41.03±0.85，P＜0.05；HBeAg: 55.25±1.42VS36.26±0.97，P＜0.01；HBV DNA: 56.81±2.37VS43.71±0.98，P＜0.01）；Ⅰ:2组、1:4组、1:8组差异无显著性；1:16组则作用较LA组低。药物作用lOd时，各含Lac-PLL-LA血清组抗HBV作用均比较显著。与LA组比较，含Lac-PLL-LA血清1:1组抗HBV DNA作用优于LA组（67.2312.79 vs 48.02±1.03，P ＜0.05）；1:2组和1:4组对HBcAg及HBV DNA的作用优于LA组；1:8组和1：16组对HBV DNA作用低于LA。7.Lac-PLL-LA100mg/kg、200mg/kg在给药期间对小鼠HBV-DNA的抑制作用明显大于LA；且在停药后未见明显反跳现象。结果提示：1.偶联物能明显提高拉咪呋啶的水溶性，Lac-PLL比其它载体的载药量高。2.在人血浆中偶联物的稳定性较高，说明药物与载体之间的化学键稳定。3.用建立的HPLC法测定血浆和各组织中的拉咪呋啶浓度精密度高、方便快捷。4.小鼠尾静脉注射给药后，Lac-PLL-LA减少了药物在肾脏的分布，而肝脏中LA的浓度大大提高且维持时间较长。5.99Tcm标记的Lac-PLL-LA可在慢性乙型肝炎小鼠模型的肝组织中特异性聚集，偶联后的拉米呋啶对肝脏组织具有特异的亲和力，能提高肝脏中LA的浓度，认为乳糖化多聚赖氨酸作为肝去唾液酸糖蛋白受体介导的一种药物载体，能使LA获得较满意的肝靶向性，从而提高其抗乙肝病毒的作用。6.Lac-PLL-LA合成后能明显提高抗HBV的作用。这一研究不仅能大大提高拉咪呋定的抗HBV效果，而且为其它靶向药物的研制提供一种可行的思路，经国内外文献检索，目前尚未见诸同样的研究。表明该研究成果不仅具有重大的社会价值和经济价值，而且具有重要的理论创新价值。由于受试验对象的影响，目前尚不能直接在人体内观察偶联化合物的靶向性和抗乙肝病毒作用，下一步将在条件成熟时开展Ⅱ、Ⅲ期临床试验，为将来在临床实践中推广应用打下坚实的基础。