[01240811]富含多不饱和脂肪酸微生物油脂的研究

“富含多不饱和脂肪酸微生物油脂的研究”（001090126）是河南省2000年科技攻关项目，主要由郑州工程学院研制完成。共轭亚油酸（CLA）是由必需脂肪酸亚油酸衍生的共轭双烯酸的多种位置和几何异构体的总称，在其十几种立体异构体中，顺-9，反-11和反-10，顺-12两种异构体被证实具有很强的生理活性，在功能性食品和医药领域具有广泛的应用前景。为了满足对活性共轭亚油酸的需求，目前普遍使用化学方法进行合成，但得到的是多种位置和几何异构体的混合物，而利用微生物可以产生专一性亚油酸异构酶的特点，可以得到比较纯的活性共轭亚油酸异构体，因此该课题的研究具有重要的意义。目前，在共轭亚油酸的合成方面，对于能产生高活性亚油酸异构酶的微生物菌株的筛选，亚油酸异构酶的分离纯化、性质及其基因的研究很少，由于条件所限，该课题就前几个方面进行了富有开创性的研究，得出了以下结论：1. 利用嗜酸乳杆菌合成共轭亚油酸是可行的，经紫外线诱变和筛选，得到一株能将亚油酸转化为共轭亚油酸的高转化率突变株，其亚油酸转化率达38.1%，培养物用超声波处理后，转化率可提高到70.5%。2. 菌体产酶培养的最佳条件为：最佳培养基脱脂乳培养基，最适补充碳源、氮源及添加量分别为乳糖1%、（NH4）_2SO_4 1%，接种量1%，接种菌体个数5×10^8个/ml，培养温度37℃，培养时间36h。在此条件下，亚油酸异构酶活力可达252.0U/ml。此外，添加0.1%的亚油酸、1%NaCl、卵磷脂、低分子量乳清蛋白能促进亚油酸异构酶的合成。3. 亚油酸异构酶转化亚油酸为共轭亚油酸的最佳条件为：pH4.0，温度35℃，保温时间48h，亚油酸与含酶培养液比例为1000mg：100ml。在此条件下，亚油酸转化为共轭亚油酸的转化率达38.1%。在1mmol/L的浓度下，Na^+、Fe^(2+)、Mg^(2+)有助于提高共轭亚油酸的产量， Hg^(2+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)、Fe^(3+)不利于共轭亚油酸的合成，而Ca^(2+)、Zn^(2+)、Co^(2+)的影响不明显。4. 粗酶液经过饱和硫酸铵盐析、调节pH值沉淀分离、Sephadex G-100凝胶过滤层析等分离纯化步骤后，所得亚油酸异构酶在SDS-PAGE上只有一条谱带，其分子量约为40700 Dal，说明亚油酸异构酶由一种亚基构成。5. 该课题得到的亚油酸异构酶的最适反应温度在30～40℃之间，60℃以下该酶稳定，超过80℃酶活力几乎全部丧失；该酶的最适作用pH值为4.0左右，在pH2.0～7.0范围内酶稳定，pH值超过8.0时几乎无催化能力；在1mmol/L的浓度下，Hg^(2+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)、Fe^(3+)对酶活性具有抑制作用， Na^+、Mg^(2+)、Fe^(2+)能提高酶活力，而Ca^(2+)、Zn^(2+)、Co^(2+)的影响不明显，这与金属离子对亚油酸转化率的影响相一致。以亚油酸为底物时，该酶的反应动力学常数为21.6mmol/L，最大反应速度为0.714mmol/L·h。6. 该课题得到的亚油酸异构酶是胞内酶，它以细胞形式进行反应时，亚油酸转化率为38.1%，用超声波处理细胞以后，转化率显著提高，可达70.5%。以上研究结果对于进一步开展亚油酸异构酶基因的克隆和转基因研究，以及今后在工业上应用酶法专一性地大量合成共轭亚油酸活性异构体，满足人们对共轭亚油酸的需求都具有重要的指导作用，其经济效益也是显而易见的。经中国科学技术信息研究所做查新表明，国内未发现与本技术相同的文献和专利报道，因此该技术在国内属于创造性成果。