[01195196]定向进化技术在人参皂苷生物转化中的应用

该课题来源于吉林省科技发展计划项目。 （一）必要性和意义 人参皂苷的生物转化,尤其是酶法转化是人参研究领域的重要课题,本项目首次将定向进化技术应用于人参皂苷生物转化的研究,一方面在理论上可以深层次揭示生物转化的底物选择性、立体选择性等深入的规律性问题,另一方面通过体外进化获得具有特殊功能的进化酶,可以更好的服务于生物技术产业,为工业化大量生产稀有人参皂苷奠定基础。 人参皂苷是人参产生的次级代谢产物,是人参的主要活性成分。研究表明,人参皂苷可广泛用于心血管系统、神经系统、免疫系统和内分泌系统等的防护和治疗,其中稀有人参皂苷以其极高的药用价值和应用前景而备受关注。但是由于稀有人参皂苷在人参中含量太低,从人参中直接提取显然不符合实际。目前的化学合成技术步骤复杂、产率很低,也难以工业生产。因此,亟待开展新型绿色环保生产工艺的研究以提高这些稀有人参皂苷的转化率和中药材资源的利用效率,降低稀有人参皂苷的生产成本。 近年来,通过生物转化法,尤其是酶法转化生产稀有人参皂苷因具有条件温和、不破坏皂苷结构、操作步骤简单、选择性高、得率高、易于分离纯化、无污染等优点,己成为制备稀有人参皂苷的首选,具有良好的发展前途。尽管如此,目前稀有人参皂苷的酶法转化研究仍处于初级阶段,如：酶的筛选、分离纯化及酶的性质研究不多,而生物转化的底物选择性、立体选择性等深入的规律性问题的研究也有待深入;已经获得的天然转化酶及重组转化酶数量十分有限,其活性,底物特异性及稳定性常常成为限制其工业应用的主要方面。定向进化技术作为一项较为成熟的技术,在提高酶分子的催化活力、底物专一性、分子稳定性等方面成果显著。应用定向进化技术对人参皂苷转化酶进行分子设计和体外进化,将为人参皂苷生物转化研究开拓新领域,也对生物技术产业具有重大现实意义。 （二）产业、产品及市场对该项目的技术需求。 人参皂苷Rb1,Rb2,Rc,Re,Rg1的含量较高,而人参皂苷Rg3,人参皂苷Rh2,人参皂苷化合物 K （C-K）等含量极少,在白参中不存在,只存在于红参和野山参中,为稀有人参皂苷,含量也只有十万分之几,近年许多药理研究表明,稀有人参皂苷药效更为珍贵,在某些难治性疾病如肿瘤治疗方面显示独特的疗效。从中药中提取这些有效成分并开发成临床用药或保健品已成为当今医药保健市场的一大热点。然而由于这些天然产物大多含量低、价格昂贵,过度开发对自然资源和人居环境均造成了不可挽回的破坏和损失。因此,利用中药材自身的次生代谢产物开展其有效成分高产率生物转化及其工业技术研究具有极大的技术优势和市场潜力,符合社会发展和资源保护的需要。 （三）、相关技术国内外发展现状与趋势 人参皂苷的酶法转化通过水解主要人参皂苷的侧链糖苷键来获得稀有人参皂苷,因而糖苷酶成为首先被研究的能够用于人参皂苷转化的酶类。与化学方法相比,利用糖苷酶进行糖苷类化合物的生物转化具有许多优势,如酶催化的区域选择性和立体选择性高、得率高、易于分离纯化、无污染等,是一种自然并令人们在心理上也易于接受的方法。目前大部分研究尚处于起步阶段,产业化的项目相对较少,还需要研究人员不断的努力寻找新思路与新技术,从而实现产业化并降低生产成本。 酶分子定向进化是从一个或多个已经存在的亲本酶出发,经过基因的突变和重组,构建一个人工突变酶库,通过筛选最终获得预先期望的具有某种特性的进化酶。利用定向进化技术可以弥补天然酶的不足,获得自然界中不存在的新的有价值酶,以满足工业生产的需要。目前,定向进化技术作为一项较为成熟的技术,已经有许多的成功应用,如在提高酶分子的催化活力,提高酶分子的底物专一性,提高分子稳定性等方面成果显著。 本项目是首次定向进化技术应用于人参皂苷生物转化的创新性探索。这一创新性工作将可能揭示生物转化的底物选择性、立体选择性等深入的规律性问题,并为稀有人参皂苷的工业制备提供新型酶源。 （四）创新点 1)应用基因工程技术构建高温人参皂苷转化酶工程菌,建立重组高效表达和酶分子优化体系。 2)应用易错PCR,gene shuffling等定向进化改造技术和定点突变等技术对酶基因进行分子改造,提高酶的催化效率。开拓人参皂苷生物转化研究的新领域。 3)通过重组酶发酵工艺的研究,降低其工业应用成本,从而使其大规模生产成为可能。为生物技术产业提供新酶源。 （五）主要成果简介 本研究应用定向进化技术对高温人参皂苷转化酶进行分子设计和体外进化,建立重组高效表达和酶分子优化体系,通过重组酶发酵工艺的研究,降低其工业应用成本,为人参皂苷生物转化研究开拓新领域,对生物技术产业具有重大现实意义。