[01127364]线粒体蛋白 mitoNEET 对锌与铁硫簇结合功能研究

人线粒体蛋白 mitoNEET 是新发现的 2 型糖尿病药物吡格列酮的靶蛋白,其含有 1 个[2Fe-2S]型铁硫簇,该铁硫中心与 Cys72、 Cys74、 Cys83 及 His87 四个氨基酸残基配位结合,前期研究显示 mitoNETT 除能结合[2Fe-2S]型铁硫簇外,改蛋白还具有锌离子的结合能力。 故本项目在基金支持下确立了以下 3 个研究内容： 1) 确定锌在 mitoNEET 中的结合位点; 2) 明确 mitoNEET 中锌和铁硫簇相互竞争关系; 3) 探究 mitoNEET 在细胞质中铁硫簇形成中的功能。 针对究内容我们采取如下研究方法：1)通过定点突变技术将 mitoNEET 蛋白中 Cys72、Cys74、Cys83 以 His87 四个氨基酸残分别突变为丝氨酸,分析突变之后的 mitoNEET 突变体蛋白 C72、 C74、 C83 和 H87S 是否同时失去铁硫簇和锌的结合能力,从而确定锌结合位点和铁硫簇结合位点是否一致; 2) 通过大肠杆菌体内表达 mitoNEET 重组蛋白培养基中添加金属 Zn/Fe 和纯化的重组 mitoNEET 蛋白体外金属结合试验来验证锌与铁硫簇在 mitoNEET 中的竞争关系; 3) 通过体外试验分析 mitoNEET-[2Fe-2S]蛋白中[2Fe-2S]能否转移到细胞质铁硫簇组装支架蛋白复合体（ Cfd1/Nbp35）上,从而确定 mitoNEET 是否具有铁硫簇的转运功能; 通过 siRNA 技术下调 MCF-7 细胞中的 mitoNEET 蛋白,分析细胞质和线粒体中的铁硫蛋白合成,从而分析 mitoNEET 在线粒体内和细胞质内铁硫簇合成的功能。 我们通过对人线粒体蛋白 mitoNEET 对锌与铁硫簇结合功能研究,确定了 mitoNEET 锌的结合位点与铁硫簇结合位点一致（ Cys72、 Cys74、 Cys83 及 His87四个氨基酸残基）;阐明了锌与[2Fe-2S]簇在 mitoNEET 蛋白中相互竞争关系;明确了 mitoNEET 在细胞质铁硫蛋白 c-Aconitase 中铁硫簇组装的作用;同时还探究了 mitoNEET 中铁硫中心的氧化还原机制。共发表论文6篇,在国际专业期刊发表学术论文 3 篇,其中包括 TOP 期刊 1 篇,国内一级期刊3篇;获得授权国家发明专利 1 项;期间参加学术会议8人次;转入国家自然科学基金青年项目 1 项;培养博士研究生 1 名,硕士研究生 2 名。